人EGFR突变基因检测试剂注册申报现状及共性问题概述
1.前言
人表皮因子生长受体（EGFR）突变基因检测试剂是指基于位点特异荧光-核酸聚合酶链式反应（ARMS-PCR法）、基因测序方法等技术，以EGFR突变基因序列为检测目标，体外检测人体病理组织和/或外周血等样本的体外诊断试剂。人EGFR突变基因是肿瘤个体化靶向治疗分子，目前靶向EGFR突变基因的药物主要有两类：一类是作用于EGFR胞外区的单克隆抗体，阻断EGFR与配体的结合，从而阻断下游信号转导途径；一类是作用于胞内酪氨酸激酶活性区域的小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI），如gefitinib和erlotinib。研究表明EGFR突变基因在多种肿瘤细胞中存在，这些突变基因是肿瘤患者是否对TKI敏感的预测因子且被认为是TKI治疗的有效预测指标。
随着一代EGFR-TKIs治疗药物的使用，也发现了一些可能的耐药突变，如发生在外显子20上的替代突变T790M。针对这些耐药突变，目前也开发了一些新型药物，如针对T790M耐药的新药物等。此外，还有许多类型的突变临床意义尚不明确。
2.该类产品注册审评现状
在我国依据《体外诊断试剂注册管理办法》，人EGFR突变基因检测试剂属于与人基因检测相关的试剂，按照第三类产品进行管理。在美国FDA，人EGFR突变基因检测试剂被归为体细胞突变基因检测系统，按照上市前审批（PMA）管理。检测人EGFR突变基因的方法学主要有位点特异PCR荧光探针法，基因测序法，数字PCR法等，不同方法学之间在检测性能方面也存在明显差异。
3.人EGFR突变基因检测试剂申报过程中的共性问题
3.1产品说明书中预期用途的表述
目前该类产品申报说明书中存在预期用途指向不明确、表述不清晰等问题。申请人需规范预期用途表述形式，结合该类产品临床评价数据与肿瘤个体化诊疗药物联合治疗情况客观描述产品预期用途。依据《体外诊断试剂产品说明书指导原则》要求，预期用途需规范EGFR不同突变基因型别表达形式，明确产品外显子、突变位点、cosmic代码等信息。
申请人需依据自身完成的药物诊疗个体化伴随检测研究工作，注意写明申报产品与个体化肿瘤药物联合临床研究相关信息。介绍EGFR突变基因检测的临床背景，包括检测相关适用人群特征、肿瘤组织类型、适用样本类型、待测靶基因序列特征及选择依据，靶基因及其表达蛋白在恶性肿瘤发生、发展过程中可能起到作用，相关药物或其他治疗技术及其作用机理、与待测突变位点可能存在关系等。
3.2临床研究相关问题
研究表明，EGFR突变基因被检测人群之间存在种族差异。亚裔人群中非小细胞肺癌患者EGFR突变基因阳性率明显高于高加索人群，但目前我国人群肿瘤突变基因数据库缺乏，申请人进行该试剂注册申报前均需完成我国境内临床研究资料，满足《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》要求，且需提供EGFR基因型与肿瘤个体化治疗临床意义相关研究资料。非小细胞肺癌人群中，如申报产品部分可检测基因型未发现存在该类突变基因阳性结果，可能与该部分突变基因在我国人群突变频率较低或总样本人群选择存在偏倚有关。针对该类问题，建议申请人扩大临床样本人群或根据不同突变基因突变频率特点，增加不同地域的临床研究机构，提高这部分突变基因阳性检出率。
3.3关于检测人外周血样本相关问题
申报产品中最常见的样本类型为中性福尔马林固定石蜡包埋病理组织（病理）,且获取肿瘤基因相关信息的主要来源仍是肿瘤病理组织样本。研究结果表明，随着肿瘤细胞的凋亡，肿瘤游离DNA（ctDNA）片段释放到人体血液循环中，通过对外周血肿瘤游离DNA的检测解读，也可以较好地了解肿瘤病情的发展情况以及寻找适合的治疗方案，尤其对于那些无法通过手术取得肿瘤组织或希望在治疗后对病情进行跟踪随访的人群，是一种理想和有效的检测手段。但由于血液游离DNA含量及变异情况会随着肿瘤病情的发展、转移性肿瘤的发生以及用药治疗情况发生实时的变化，外周血检测EGFR突变基因检测结果存在一定的不确定性。两种样本在用于人EGFR-TIK治疗效果也存在差异。
鉴于上述原因，人EGFR突变基因检测试剂如适用于外周血样本检测人群，预期用途需限定为晚期NSCLC患者，且作为不能获取NSCLC组织样本时的补充手段。鉴于病理组织样本和外周血样本中EGFR突变基因比例不同，申报产品需分别对检测外周血样本和病例组织样本进行最低检出限的研究。
3.4关于适用样本采集储存相关问题
病理组织样本需详细介绍组织学样本类型，包括样本来源及取材要求、组织标本采集厚度、样本处理方式（如组织样本的固定及包埋方式）、肿瘤细胞比例等。在对核酸序列进行检测前，需对用于肿瘤组织突变基因检测的标本进行评估，并富集存在EGFR突变基因的肿瘤细胞用于核酸提取。肿瘤细胞所占比例需达到所用检测方法的要求。
外周血采集后，需通过验证试验规定外周血存放条件以及存放时限及温度设置等，包括采用加入抗核酸降解的采血管要求。样本采集管或保存管中所用的防腐剂、抗凝剂、保护剂等辅助成分不应对基因序列扩增产生干扰。血液通常需要先进行抗凝保存，应关注抗凝剂的选择。申请人需对抗凝剂、防腐剂、保护剂等成分进行验证。
因外周血中ctDNA含量低，为提高EGFR突变基因检出率，在临床允许的情况下推荐增加血浆用量。抽血后延迟血浆分离会导致血细胞裂解，释放出基因组DNA（gDNA）至血浆中；大量增加的gDNA会稀释肿瘤来源的ctDNA，使得突变难以检出。因此在标本采集、运输及储存过程中，防止游离DNA降解是首要考虑因素；其次，也应防止血液中白细胞裂解，避免因野生型DNA增加导致ctDNA中EGFR突变基因无法检测。
3.5产品研发申报难点
人EGFR突变基因检测试剂联合治疗产品使用，用于指导用药或者预后判断，该类产品属于伴随诊断产品，与治疗药物使用安全有效密切相关。美国FDA曾发布伴随诊断产品指导文件，鼓励申请人同步进行治疗产品与伴随诊断产品研发与上市前申请。我中心鼓励申请人在伴随诊断试剂研发时应充分联合治疗药物对产品进行临床评价。但国内具体开发创新性肿瘤个体化药物的生产企业较少，目前多为国外专利期到期后肿瘤个体化药物的仿制药研究。这也给从事该类体外诊断试剂的生产企业开展创新性肿瘤个体化伴随临床研究带来困难。
4.小结
人EGFR突变基因检测目前是EGFR-TKIs治疗的重要检测靶点，随着核酸检测技术的发展，如：BEAMing技术、数字PCR、高通量测序技术运用于肿瘤个体化治疗，相关突变基因检测越来越受到临床专家和行业研究人员关注。不同于目前临床常规成熟且推荐的检测技术，新的检测技术如何定位、临床个体化应用与临床个体化研究两者存在差异、临床转化医学研究如何有效转化为临床应用，都将是今后注册审评关注重点。
参考文献：
1. FDA,In Vitro Companion Diagnostic Devices,Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff, 2014-08-06.
2.《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》制定专家组.非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识. 中华医学杂志2015年12月8日第95卷第46期
3.中国医师协会肿瘤医师分会，中国抗癌协会肿瘤临床化疗专业委员会.中国表皮生长因子受体基因敏感突变和间变淋巴瘤激酶融合基因阳性非小细胞肺癌诊断治疗指南(2014版) 中华肿瘤杂志2014年7月第36卷第7期
审评六部 吴传松供稿
人表皮因子生长受体（EGFR）突变基因检测试剂是指基于位点特异荧光-核酸聚合酶链式反应（ARMS-PCR法）、基因测序方法等技术，以EGFR突变基因序列为检测目标，体外检测人体病理组织和/或外周血等样本的体外诊断试剂。人EGFR突变基因是肿瘤个体化靶向治疗分子，目前靶向EGFR突变基因的药物主要有两类：一类是作用于EGFR胞外区的单克隆抗体，阻断EGFR与配体的结合，从而阻断下游信号转导途径；一类是作用于胞内酪氨酸激酶活性区域的小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI），如gefitinib和erlotinib。研究表明EGFR突变基因在多种肿瘤细胞中存在，这些突变基因是肿瘤患者是否对TKI敏感的预测因子且被认为是TKI治疗的有效预测指标。
随着一代EGFR-TKIs治疗药物的使用，也发现了一些可能的耐药突变，如发生在外显子20上的替代突变T790M。针对这些耐药突变，目前也开发了一些新型药物，如针对T790M耐药的新药物等。此外，还有许多类型的突变临床意义尚不明确。
2.该类产品注册审评现状
在我国依据《体外诊断试剂注册管理办法》，人EGFR突变基因检测试剂属于与人基因检测相关的试剂，按照第三类产品进行管理。在美国FDA，人EGFR突变基因检测试剂被归为体细胞突变基因检测系统，按照上市前审批（PMA）管理。检测人EGFR突变基因的方法学主要有位点特异PCR荧光探针法，基因测序法，数字PCR法等，不同方法学之间在检测性能方面也存在明显差异。
3.人EGFR突变基因检测试剂申报过程中的共性问题
3.1产品说明书中预期用途的表述
目前该类产品申报说明书中存在预期用途指向不明确、表述不清晰等问题。申请人需规范预期用途表述形式，结合该类产品临床评价数据与肿瘤个体化诊疗药物联合治疗情况客观描述产品预期用途。依据《体外诊断试剂产品说明书指导原则》要求，预期用途需规范EGFR不同突变基因型别表达形式，明确产品外显子、突变位点、cosmic代码等信息。
申请人需依据自身完成的药物诊疗个体化伴随检测研究工作，注意写明申报产品与个体化肿瘤药物联合临床研究相关信息。介绍EGFR突变基因检测的临床背景，包括检测相关适用人群特征、肿瘤组织类型、适用样本类型、待测靶基因序列特征及选择依据，靶基因及其表达蛋白在恶性肿瘤发生、发展过程中可能起到作用，相关药物或其他治疗技术及其作用机理、与待测突变位点可能存在关系等。
3.2临床研究相关问题
研究表明，EGFR突变基因被检测人群之间存在种族差异。亚裔人群中非小细胞肺癌患者EGFR突变基因阳性率明显高于高加索人群，但目前我国人群肿瘤突变基因数据库缺乏，申请人进行该试剂注册申报前均需完成我国境内临床研究资料，满足《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》要求，且需提供EGFR基因型与肿瘤个体化治疗临床意义相关研究资料。非小细胞肺癌人群中，如申报产品部分可检测基因型未发现存在该类突变基因阳性结果，可能与该部分突变基因在我国人群突变频率较低或总样本人群选择存在偏倚有关。针对该类问题，建议申请人扩大临床样本人群或根据不同突变基因突变频率特点，增加不同地域的临床研究机构，提高这部分突变基因阳性检出率。
3.3关于检测人外周血样本相关问题
申报产品中最常见的样本类型为中性福尔马林固定石蜡包埋病理组织（病理）,且获取肿瘤基因相关信息的主要来源仍是肿瘤病理组织样本。研究结果表明，随着肿瘤细胞的凋亡，肿瘤游离DNA（ctDNA）片段释放到人体血液循环中，通过对外周血肿瘤游离DNA的检测解读，也可以较好地了解肿瘤病情的发展情况以及寻找适合的治疗方案，尤其对于那些无法通过手术取得肿瘤组织或希望在治疗后对病情进行跟踪随访的人群，是一种理想和有效的检测手段。但由于血液游离DNA含量及变异情况会随着肿瘤病情的发展、转移性肿瘤的发生以及用药治疗情况发生实时的变化，外周血检测EGFR突变基因检测结果存在一定的不确定性。两种样本在用于人EGFR-TIK治疗效果也存在差异。
鉴于上述原因，人EGFR突变基因检测试剂如适用于外周血样本检测人群，预期用途需限定为晚期NSCLC患者，且作为不能获取NSCLC组织样本时的补充手段。鉴于病理组织样本和外周血样本中EGFR突变基因比例不同，申报产品需分别对检测外周血样本和病例组织样本进行最低检出限的研究。
3.4关于适用样本采集储存相关问题
病理组织样本需详细介绍组织学样本类型，包括样本来源及取材要求、组织标本采集厚度、样本处理方式（如组织样本的固定及包埋方式）、肿瘤细胞比例等。在对核酸序列进行检测前，需对用于肿瘤组织突变基因检测的标本进行评估，并富集存在EGFR突变基因的肿瘤细胞用于核酸提取。肿瘤细胞所占比例需达到所用检测方法的要求。
外周血采集后，需通过验证试验规定外周血存放条件以及存放时限及温度设置等，包括采用加入抗核酸降解的采血管要求。样本采集管或保存管中所用的防腐剂、抗凝剂、保护剂等辅助成分不应对基因序列扩增产生干扰。血液通常需要先进行抗凝保存，应关注抗凝剂的选择。申请人需对抗凝剂、防腐剂、保护剂等成分进行验证。
因外周血中ctDNA含量低，为提高EGFR突变基因检出率，在临床允许的情况下推荐增加血浆用量。抽血后延迟血浆分离会导致血细胞裂解，释放出基因组DNA（gDNA）至血浆中；大量增加的gDNA会稀释肿瘤来源的ctDNA，使得突变难以检出。因此在标本采集、运输及储存过程中，防止游离DNA降解是首要考虑因素；其次，也应防止血液中白细胞裂解，避免因野生型DNA增加导致ctDNA中EGFR突变基因无法检测。
3.5产品研发申报难点
人EGFR突变基因检测试剂联合治疗产品使用，用于指导用药或者预后判断，该类产品属于伴随诊断产品，与治疗药物使用安全有效密切相关。美国FDA曾发布伴随诊断产品指导文件，鼓励申请人同步进行治疗产品与伴随诊断产品研发与上市前申请。我中心鼓励申请人在伴随诊断试剂研发时应充分联合治疗药物对产品进行临床评价。但国内具体开发创新性肿瘤个体化药物的生产企业较少，目前多为国外专利期到期后肿瘤个体化药物的仿制药研究。这也给从事该类体外诊断试剂的生产企业开展创新性肿瘤个体化伴随临床研究带来困难。
4.小结
人EGFR突变基因检测目前是EGFR-TKIs治疗的重要检测靶点，随着核酸检测技术的发展，如：BEAMing技术、数字PCR、高通量测序技术运用于肿瘤个体化治疗，相关突变基因检测越来越受到临床专家和行业研究人员关注。不同于目前临床常规成熟且推荐的检测技术，新的检测技术如何定位、临床个体化应用与临床个体化研究两者存在差异、临床转化医学研究如何有效转化为临床应用，都将是今后注册审评关注重点。
参考文献：
1. FDA,In Vitro Companion Diagnostic Devices,Guidance for Industry and Food and Drug Administration Staff, 2014-08-06.
2.《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》制定专家组.非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识. 中华医学杂志2015年12月8日第95卷第46期
3.中国医师协会肿瘤医师分会，中国抗癌协会肿瘤临床化疗专业委员会.中国表皮生长因子受体基因敏感突变和间变淋巴瘤激酶融合基因阳性非小细胞肺癌诊断治疗指南(2014版) 中华肿瘤杂志2014年7月第36卷第7期
审评六部 吴传松供稿