本指导原则旨在指导注册申请人对乙型肝炎病毒耐药相关的基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。

本指导原则是针对乙型肝炎病毒耐药相关的基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。

本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。

本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。

适用范围

（一）临床背景

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，但不同地区HBV 感染的流行强度差异很大。全国2006年乙型肝炎血清流行病学调查表明，我国1-59岁一般人群乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性率为7.18%，2014年中国疾病预防控制中心开展的全国1—29岁人群乙型肝炎血清流行病学调查结果显示，1—4岁、5—14岁、15—29岁人群HBsAg阳性率分别为0.32%、0.94%和4.38%，我国现有HBV感染者约有8000万。在临床治疗慢性乙型肝炎病毒感染的方案中，使用抗病毒药物是最主要的手段。抗HBV药物主要包括干扰素α和核苷（酸）类似物两大类，其中核苷（酸）类药物服用便捷，抗病毒效力强，不良反应较小，但核苷（酸）类药物在抗HBV治疗中需要长期服药，一旦出现病毒耐药，可能导致治疗失败、病毒DNA反弹、肝功能恶化甚至肝衰竭。因此，如何发现病毒耐药突变，进而合理调整治疗方案，在慢性乙型肝炎临床治疗中具有极其重要的意义。

HBV属于嗜肝DNA病毒科（hepadnaviridae），HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框（ORF），即前-S/S区、前-C/C 区、P区和X区。其中P区编码聚合酶/逆转录酶，目前已知的核苷（酸）类药物的耐药突变均发生在HBV的P区。HBV虽然属于DNA病毒，但其复制需经过以前基因组RNA为复制中间体的逆转录过程。在此过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高。HBV复制的这种过程和特点，导致同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差异，因此，每一个患者体内的病毒都是由不同基因序列的病毒株组成的动态变化的病毒准种，不同基因序列的病毒株在病毒准种中所占的相对比例，一方面取决于病毒株自身的复制能力，另一方面也受到机体免疫系统或药物的选择压力的影响。

抗病毒药物核苷（酸）类似物进入机体后，形成三磷酸活性成分，与机体天然的脱氧三磷酸核苷（dNTP）竞争性结合到HBV聚合酶上，使HBV的DNA链合成终止。如果患者体内的HBV P区序列发生突变，导致产生的HBV聚合酶与核苷（酸）类似物结合力降低，突变的HBV即不受核苷（酸）类似物的抑制或抑制能力下降，在继续应用核苷（酸）类似物治疗的情况下，突变株病毒由于对核苷（酸）类似物不敏感而逐渐成为优势株，从而导致患者对于核苷（酸）类似物的耐药。

乙型肝炎病毒的耐药突变分为原发性耐药突变和补偿性耐药突变，原发性耐药突变指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生突变，导致突变病毒株对治疗药物的敏感性下降。虽然原发性耐药突变株对药物的抵抗性增加，但也常导致突变病毒本身的复制能力下降。补偿性耐药突变指由于原发性耐药突变病毒株复制能力下降，在原发性耐药突变的基础上，病毒株在其它位点发生突变，这些突变可部分恢复突变病毒的复制能力或可导致突变病毒对药物敏感性的进一步下降。

目前经国家药品监督管理局批准用于抗HBV治疗的核苷（酸）类似物有拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替比夫定（LdT）、替诺福韦酯（TDF）和富马酸丙酚替诺福韦（TAF）等。与拉米夫定常见耐药相关的突变为rtM204I/V和rtL180M，其中rtM204V多与rtL180M联合出现，rtM204I可单独出现。与阿德福韦酯常见耐药相关的突变为rtN236T与rtA181V/T，两个位点可单独或联合出现。与恩替卡韦常见耐药相关的突变是在rtM204V+rtL180M基础上，再联合rtT184、rtS202或rtM250三个位点中至少一个位点的氨基酸替代突变。与替比夫定常见耐药相关的突变为rtM204I，其它位点如rtA181V/T等尚存在争议。替诺福韦酯和富马酸丙酚替诺福韦目前尚未发现确认的耐药突变。

HBV耐药相关的检测主要包括基因型耐药检测和体外表型分析等。

HBV基因型耐药检测是指采用分子生物学方法检测已在体外表型分析中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV突变的临床检测。目前已批准产品采用的方法主要包括：PCR-测序法（direct PCR sequencing）、基因芯片法（gene chip）、PCR-反向杂交法（PCR-reverse hybridization assay）、实时荧光PCR法（real-time PCR）等。

HBV体外表型分析（in vitro phenotypic analysis）是公认的确认耐药的检测方法，通过体外复制系统证实检测到的HBV突变会降低其对抗病毒药物的敏感性，常用半数有效浓度（50% effective concentration，EC50）或半数抑制浓度（50% inhibitory concentration，IC50）来评价耐药程度的高低。其方法是将含有待检测耐药突变位点的HBV全基因组导入肝细胞来源的细胞系，再将不同浓度梯度的核苷（酸）类似物加入细胞培养液中，经过一定培养时间后检测药物作用下HBV DNA的复制情况，计算EC50，通过与野生株病毒的EC50比较，判断该突变对核苷（酸）类似物的敏感性。当抑制病毒复制所需的EC50与野生株相比增加l00倍以上称为高度耐药、l0—99倍为中度耐药、2—9倍为轻度耐药。

（二）本指导原则适用范围

本指导原则所述乙型肝炎病毒耐药相关的基因突变检测试剂是指利用分子生物学技术，对人体血清/血浆样本中乙型肝炎病毒耐药突变位点进行定性检测的试剂。临床适用人群为核苷（酸）类似物治疗过程中出现病毒学突破的患者。除非有明确证据表明初治患者感染HBV来自接受核苷（酸）类似物抗病毒治疗患者，一般不主张对初治患者进行基因型耐药检测。

本指导原则是基于实时荧光PCR方法对产品相关申报资料提出要求，其他方法学的产品可依据产品特性确定其中具体内容是否适用，如不适用，可另行选择符合自身方法学特性的技术要求或评价方法。

本指导原则适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品。其他未尽事宜应当符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）（以下简称《办法》）等相关法规要求。

详细内容，见https://www.cmde.org.cn/CL0112/20613.html